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Metodiche
- Caratterizzazione funzionale di mutanti p53 mediante saggi funzionali in lievito: determinazione (1) della sensibilità alla temperatura; (2) della capacità di transattivazione differenziale; (3) del potere dominante; (4) della capacità di interferire con l’attività transattivante di p73.
- Caratterizzazione funzionale di mutanti p53 in linee cellulari umane: analisi della capacità della p53 di legare i promotori di geni target, da essa regolati, mediante la tecnica della Chromatin Immuno-Precipitation (ChIP). La quantificazione del legame ai diversi promotori viene effettuata tramite PCR quantitativa sul DNA immunoprecipitato da anticorpi specifici per p53. Lo studio dei livelli di espressione degli stessi geni target avviene attraverso RT-PCR semiquantitativa e in real time, mentre la determinazione dei livelli proteici di p53 ed altre proteine da essa regolate viene effettuata con Western blot.
- Capacità transattivante nei confronti di promotori bersaglio e loro varianti polimorfiche: saggi di attivazione trascrizionale in lievito, in linee cellulari con l’impiego della luciferasi; identificazione di polimorfismi (RFLP) in sequenze regolatrici e non.
- 8OH-dG: metodologie biochimiche per la quantificazione di ATP; Western blot per la quantificazione dell’espressione di proteine; estrazione e purificazione del DNA; sintesi e caratterizzazione (HPLC) di basi modificate del DNA; quantificazione di 8-OHdG in HPLC/EC.
- Riparazione del DNA: saggi in vitro di riparazione del DNA. In particolare: saggi di incisione su substrati
oligonucleotidici contenenti una singola lesione; saggi di riparazione replicativa su substrati plasmidici contenenti una singola lesione;
espressione di proteine fluorescenti della riparazione del DNA in cellule umane; quantificazione dell'espressione tramite analisi di
fluorescenza e western blotting; studio delle frequenze di mutazione indotte in cellule umane da agenti ossidanti.
- HNSCC: saggio del micronucleo.
- Coltivazione e caratterizzazione di cellule
staminali di glioma: analisi morfologica, analisi del ciclo cellulare,
sensibilità ad agenti alchilanti e radiazione ionizzante, analisi del cariotipo,
analisi dei micronuclei spontanei ed indotti, riparazione per escissione di
basi, comet assay.
Attrezzature
- Spettrofotometro
- Thermalcyclers
- Luminometro
- Speedvac
- Apparecchio per real time PCR, Rotor Gene 3000 dotato di CAS-1200 (dispensatore di liquidi automatico) - d'Istituto
- Sonicatore Sonoplus HD2070
- Incubatore refrigerato Mod 2800
- Frigotermostato “Body” FTD 250 plus
- Strumentazione dedicata per la analisi di 8-OHdG: detector elettrochimico, in parallelo con detezione UV in HPLC.
- Typhoon 9200 Variable Mode Imager
- Gel dryer
- Microscopi con ingrandimenti 10X, 40X, 100X
- Analizzatore d’immagine costituito da microscopio a fluorescenza equipaggiato con 4 obiettivi, ruota a 8 filtri, telecamera B/N ad alta risoluzione, software per analisi FISH e CGH Casti
- Microscopio a fluorescenza dotato di sistema di cariotipizzazione Cytovision
- Cappe a flusso laminare Biohazard
- Centrifughe refrigerate
- Incubatori a CO2
- Incubatori per lieviti
- Cappe chimiche
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Presentazione della struttura