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Metodiche
- TAP (Tandem Affinity Purification) Method. Metodo messo a punto per la
purificazione di fattori di splicing in lievito e recentemente adattato alle cellule di mammifero, consente
la purificazione di complessi multiproteici in forma nativa sfruttando un doppio "tag" fuso alla
proteina di interesse che viene espressa in seguito a transfezione stabile. La successiva identificazione
delle proteine isolate, presenti anche in quantità minime in bande tagliate da SDS-PAGE, può essere
effettuata mediante spettrometria di massa.
- RDA (Representational Difference Analysis). Metodo che consente di paragonare due
popolazioni di cDNA che differiscono solo per l'espressione di alcuni geni. L'uso di successivi cicli di
PCR consente di utilizzare quantità minime di RNA messaggero (ad esempio estratto da tessuti embrionali di
topo).
- ChIP (Chromatin ImmunoPrecipitation). Tecnica che consente di studiare i fattori
di trascrizione che si legano a un determinato promotore e ne regolano l'attività in diverse condizioni
sperimentali, avvalendosi dell'uso di anticorpi diretti contro tali fattori di trascrizione e di una
reazione di immunoprecipitazione della cromatina seguita da una reazione di PCR che utilizza specifici
primer.
- In vitro degradation assay. Consiste nel determinare la velocità di degradazione
di mRNA sintetizzati in vitro da parte di estratti cellulari S100. Riproduce fedelmente i fenomeni biologici
che portano alla completa degradazione dell'RNA messaggero. La tecnica descritta originalmente da J. Wilusz
e collaboratori è stata da noi perfezionata per consentire di duplicare in vitro la regolazione del
turn-over di mRNA instabili da parte delle vie di trasmissione del segnale quali JNK, MAPK p38 ecc.
(Chen C., Gherzi R. et al. Genes Dev. 14:1236/1248, 2000
(PubMed Abstract).
- RIP (Ribonucleoprotein immunoprecipitation). Consiste nell'immunoprecipitare
complessi proteina-mRNA quali si formano in cellule viventi sottoposte a svariati tipi di trattamento.
Vengono individuati mediante RT/PCR i trascritti con cui una determinata proteina (o un complesso
multiproteico) interagisce al momento della fissazione delle cellule. La metodica consente di sfruttare
i vantaggi della fissazione con formaldeide, estensivamente sperimentata negli saggi di Chromatin
Immunoprecipitation (ChIP), applicandola alla immunoprecipitazione di complessi proteina-mRNA che
abbiamo precedentemente descritto (Chen C., Gherzi R. et al. Genes Dev. 14:1236/1248, 2000 PubMed Abstract). In particolare la tecnica consente lavaggi degli immunocomplessi in condizioni di estrema stringenza cio' che minimizza la possibilità di ottenere prodotti non specifici in seguito a RT/PCR.
- CLIP-sequencing, consiste nella purificazione mediante immunoprecipitazione di
complessi ribonucleoproteici seguita da estrazione dell'RNA e suo sequenziamento "high-throughput". Consente
l'individuazione simultanea di microRNA e di mRNA loro target.
- In vitro processing di precursori di miRNA, consiste nell'analisi in vitro della
maturazione dei microRNA a partire dai loro precursori e permette di analizzare questa funzione biologica
in estratti di cellule sottoposte a diversi trattamenti e/o condizioni sperimentali.
Attrezzature
- FPLC
- PCR
- Apparato per PCR quantitativa
- Microscopi da ricerca in campo chiaro e a fluorescenza
- Micromanipolatori per microiniezione
- Cappe a flusso laminare
- Incubatori a CO2
- Incubatori per batteri
- Incubatori per la produzione di Baculovirus
- Sistemi elettroforetici per proteine e acidi nucleici
- Apparecchio per iniezione in stereotassi
- Sonicatore
- Centrifughe
- Congelatori a -80°C e ad azoto liquido
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Presentazione della struttura